免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC），即免疫组化，是利用免疫学中抗原抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（如多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。
IHC实验流程：通常包括组织样本固定、石蜡包埋、切片、切片脱蜡水化、抗原修复、灭活、封闭、一抗孵育、二抗孵育、染色显色、复染、脱水、封片、观察步骤。
图1. IHC原理图
组织样本获取与固定
从动物或人体获取目标组织样本，尽快（通常在离体后30min内）放入10-20倍组织体积的固定液（常用10%中性缓冲福尔马林、甲醇、乙醇或它们的混合液）中，保证组织能够充分浸入固定液中。固定时间根据组织大小和类型等而定，通常为18-24h。
原理：
保存结构：固定剂（如甲醛）通过交联蛋白质，迅速终止细胞内酶活性，防止组织自溶和腐败，最大程度地保存组织细胞的形态结构和抗原性。
稳定抗原：固定使抗原分子稳定在组织原位，防止在后续处理过程中扩散或流失。
硬化组织：使组织变硬，便于后续的切片操作。
脱水、透明与浸蜡
脱水：将固定好的组织样本依次通过梯度乙醇充分脱水（70%, 80%, 95%, 无水乙醇1，无水乙醇2，分别浸泡1min）→透明剂：如二甲苯，置换乙醇使组织透明→浸蜡：透明后的组织样本放入融化的石蜡。每一步都需要足够的时间让试剂充分渗透组织。
原理：
脱水：去除组织中的水分，因为水与石蜡不相容。乙醇是常用的脱水剂。
透明：用透明剂（二甲苯等）置换出乙醇。透明剂既能与乙醇混溶，又能溶解石蜡，作为中间媒介。
浸蜡：熔融的石蜡渗透入组织，取代透明剂。石蜡冷却后固化，为组织提供支撑，便于切成薄片。
包埋与切片
将浸透石蜡的组织块放入包埋模具，加入融化的石蜡，冷却凝固成蜡块。用切片机将蜡块切成4-5μm厚的连续切片。将切片漂浮在温水浴（40-45℃）中展平，然后小心地捞取到载玻片（通常使用防脱载玻片如多聚赖氨酸或APES处理的玻片）上，在60℃烘箱中烤片2h。
原理：
包埋：形成规则、坚固的蜡块，便于固定和切片。
切片：获得薄到足以透光并能在显微镜下观察的组织层。
烤片：使切片中的石蜡轻微融化，更好地粘附在载玻片上，防止后续处理中切片脱落。
脱蜡水化
将载玻片依次放入：二甲苯I→二甲苯II（或替代品）→无水乙醇→无水乙醇→95%乙醇→80%乙醇→70%乙醇→去离子水。每一步浸泡足够时间（通常5-10min），以确保石蜡被完全去除，残留石蜡会影响后续的抗原检测和染色。整个过程避免干燥，干燥会导致非特异性抗体结合，从而出现高背景染色。
原理：
脱蜡：用二甲苯溶解并去除包埋组织的石蜡。
水化：用梯度下降的乙醇逐步置换掉二甲苯，并最终用水置换掉乙醇，使组织恢复到水合状态，便于后续的水性试剂（如缓冲液、抗体）渗透和反应。
抗原修复
常用抗原修复方法有高压热修复、微波热修复、水域热修复、胰酶修复。通常使用1×柠檬酸钠（pH6.0）作为修复液，高压修复时将切片置于高压锅中，加入抗原修复液，加热至冒气后继续加热5min，关闭电源，冷却至室温，修复完毕（不同抗原适用于不同的抗原修复液及修复条件，需要根据具体实验情况来选择最适的抗原修复方法）。
原理：
由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。
灭活
灭活过氧化物酶：HRP酶标记系统，用3%过氧化氢水溶液室温孵育切片10-15min（过氧化氢现用现配，4℃避光保存）。
原理：
某些组织（如红细胞、肝、肾、粒细胞）含有内源性过氧化物酶/碱性磷酸酶或生物素，会导致非特异性背景着色。该步骤旨在灭活或阻断这些内源性物质，降低背景信号，提高实验的特异性和敏感性。
封闭
用含有蛋白质（如5-10%正常血清-通常来自二抗宿主动物，或1-5% BSA）的缓冲液（如TBS或PBS）室温孵育切片10-30min，但也要防止封闭过度。封闭也可用小牛血清、BSA、 羊血清等，但不能与一抗来源一致。
原理：
组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性。封闭液中的蛋白质（血清或BSA）会抢先占据这些非特异性结合位点，阻止后续抗体在此非特异性吸附，从而显著降低背景染色。
一抗孵育
使用抗体稀释液稀释抗体，甩去片子上的封闭液。一抗孵育一般37℃ 1-2h，或4℃过夜。具体条件还要摸索。孵育结束后，用缓冲液（TBS或PBS，通常含0.05-0.1%Tween-20等温和去污剂）充分洗涤切片，通常3次，每次5min。
原理：
去除未与抗原结合或非特异性吸附在组织切片上的一抗，减少背景染色。洗涤缓冲液中的去污剂有助于去除疏松结合的抗体。
二抗孵育
二抗室温孵育30-60min。孵育完成用洗涤缓冲液彻底洗涤3次，每次5min，去除未结合的二抗。
DAB显色
滴加新鲜配制的DAB显色液到组织上。在显微镜下密切监控显色反应（通常室温下几秒到十几分钟），待特异性棕色信号清晰可见且背景尚低时，立即将切片浸入去离子水中终止反应。
原理：
酶（HRP或AP）催化其特异性底物发生反应，生成不溶性的有色沉淀物（显色法），沉淀物沉积在抗原-抗体结合的部位，从而在光学显微镜下可视化目标抗原的位置。显色时间是关键，过长会导致背景升高甚至非特异性着色。
复染
将显色后的切片浸入苏木素染液中染色数秒至数分钟（根据染液浓度和室温调整），分化（用酸性乙醇或水去除过量染料），返蓝（自来水冲洗使胞核呈蓝色）。
原理：
苏木素是一种碱性染料，主要使细胞核的染色质（富含DNA，带负电）染成蓝色。复染是为了形成细胞轮廓，有助于定位目标蛋白（如棕色DAB阳性）在细胞内的位置以及观察组织结构。
脱水、透明与封片
脱水：将玻片依次放入装有70%乙醇→80%乙醇→95%乙醇→无水乙醇→无水乙醇→二甲苯→二甲苯（或替代品）。每一步短暂浸泡（通常1-3min）。从二甲苯中取出切片，在组织区域滴加适量中性树胶（如DPX）或水性封片剂（如用于荧光或某些水溶性显色产物的封片剂），小心盖上盖玻片，避免气泡。
原理：
脱水与透明：去除切片中的水分，并用透明剂置换乙醇，使组织透明，便于光线透过。
封片：封片剂使切片与空气隔绝，防止褪色和物理损伤；具有与玻璃相近的折射率，提高显微镜下的清晰度；固定盖玻片。
显微镜观察与结果分析
待封片剂干燥固化后，在光学显微镜（明场用于显色法，荧光显微镜用于荧光法）下观察切片。根据阳性信号的分布（细胞定位：核/浆/膜）、强度（弱/中/强）、范围和模式（弥漫/灶状/点状等）进行判读和分析。注意与阴性对照、阳性对照进行比较。
图2. 浸润性乳腺癌中雌激素受体的免疫组织化学
Immunohistochemistry for estrogen receptor in invasive breast carcinoma
（Arch Pathol Lab Med. 2022 Nov 1;146(11):1303-1307）
IHC常见问题及解决方案
非特异性染色？
1. 抗体交叉反应：抗体可能与样本中的多个抗原或非特异性结构结合，导致非特异性染色。选择高特异性的抗体，进行预吸收或使用竞争抑制实验可以减少这一问题。
2. 抗体浓度过高：过量的抗体增加了非特异性结合的机会。优化抗体浓度至最佳范围，通常需要通过预实验来确定。
3. 样本处理不当：过度固定、脱水或样本处理过程中使用的溶剂可能暴露出额外的结合位点，促进非特异性结合。优化样本处理步骤，使用温和的固定剂，并避免过度处理。
4. 洗涤不充分：不充分的洗涤步骤无法有效去除未结合的抗体或标记物，导致非特异性染色。增加洗涤次数或延长洗涤时间可以改善这一问题。
5. 检测系统敏感度过高：过于敏感的检测系统可能会放大非特异性信号。调整检测系统或信号放大步骤的敏感度，以减少非特异性染色。
6. 内源性酶活性：在使用酶标记抗体的检测系统中，内源性酶（如过氧化物酶）的活性可能引起非特异性染色。使用内源性酶抑制剂或进行酶失活步骤可以减少这一影响。
7. 样本背景复杂：高背景样本可能含有多种潜在的结合位点，增加非特异性染色的可能性。使用封闭步骤（如血清或蛋白封闭液）可以减少背景染色。
假阳性？
1. 一抗浓度及一抗是否失效，抗体有一个合适的浓度范围且必须在有效期内使用，过期的抗体或者不着色，或者背景着色，形成假阳性；
2. 试剂未充分覆盖组织，组织边缘的试剂易干浓度较组织中间高致深染；
3. 抗体孵育时间过长，由于室温的影响夏季孵育时间稍短，冬季孵育时间稍长；
4. 操作过程中组织变干，造成组织边缘收缩或损坏形成伪影，产生假阳性；
5. DAB显色时间太长，DAB宜现配现用，配制时间最好在30min以内；
6. 由于胞浆里含有较多的蛋白质，因此间质和胞浆中出现很多非特异性的染色，如内源性酶血红蛋白、肌红蛋白等造成的着色，可以通过血清封闭解决；
7. 乳腺癌组织中的脂肪细胞、淋巴细胞也会产生非特异性的染色；
8. 非特异性抗体吸附常见于坏死组织中，使坏死组织呈较高的背景染色，在免疫组化中应避免选择坏死组织较多的蜡块。
9. PBS 冲洗不充分，残留抗体结果增强着色。
染色不均匀？
1. 样本制备不一致：切片厚度不均或样本固定条件的差异，导致染色剂在样本上的分布不均匀。
2. 抗体分布不均：抗体溶液在样本上的覆盖不均匀，或在孵育过程中未能充分渗透到样本的所有区域。
3. 抗原修复不充分：抗原修复条件（如温度、时间）不一致，导致某些区域的抗原表位未充分暴露。
4. 洗涤步骤不彻底：残留的未结合抗体或标记物可能在某些区域积聚，导致染色过深。
5. 显色剂应用不均：显色剂在样本上的分布不均，或显色反应时间的不一致。
6. 样本内部结构差异：样本内部结构的差异（如细胞密度、组织类型）可能导致染色剂在不同区域的反应性不同。
弱阳性？
1. 固定方式不当或固定时温度过高，影响到抗原的数量和质量；
2. 不适当的抗原修复方式，抗原决定簇暴露不足；
3. 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间不足；
4. 孵育抗体前切片上遗留了过多的冲洗液；
5. 孵育时切片未放置水平，导致抗体孵育不均匀。
AntibodySystem开发了一系列IHC/IF/WB专用抗体，以下是部分产品目录：
|
货号 |
产品名称 |
应用 |
|
Anti-MMP9 Polyclonal Antibody |
WB, IHC, IF |
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Anti-BDNF Polyclonal Antibody |
WB, IHC, IF |
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Anti-Human CD3E Polyclonal Antibody |
WB, IHC, IF |
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|
Anti-VASN Polyclonal Antibody |
WB, IHC, IF |
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Anti-Human Fibrin Antibody (59D8) |
WB, IHC, IF |
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|
Anti-Human GZMB Antibody (SAA0516) |
WB, IHC, IF |
|
|
Anti-Human EDB/EDB-FN Antibody (SAA1375) |
WB, IHC, IF |
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|
Anti-H3K4me3 Antibody (304M3-B) |
WB, IHC, IF |
|
|
Anti-Human VEGFA Antibody (SAA0531) |
WB, IHC, IF |
|
|
Anti-Human SULT1E1 Antibody (SAA0758) |
WB, IHC, IF |
|
|
Anti-Mouse CD68/Macrosialin Antibody (SAA2218) |
WB, IHC, IF |
|
|
Anti-Mouse CD229/LY9 Antibody (D08) |
WB, IHC, IF |
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